原代細胞培養(yǎng)的應(yīng)用

1、為研究生物體細胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段;

2、為傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件;

3、服務(wù)于臨床實踐，用于藥物篩選等。

原代細胞培養(yǎng)之取材

取材作為原代細胞培養(yǎng)過程中的第一部至關(guān)重要，以下幾種取材技術(shù)，你都用過哪些方法呢？

各類組織取材，操作及注意事項：

1.皮膚和粘膜

主要取皮片，面積一般2~4平方厘米。

2.內(nèi)臟和實體瘤

（1）無菌環(huán)境；

（2）熟悉所需組織的類型和部位；

（3）要避開破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結(jié)締組織。

3.血液細胞

一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中(如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結(jié)等)分離細胞，取材時應(yīng)注意抗凝。

4.骨髓、羊水、胸/腹水細胞

嚴格無菌，注意抗凝，還要盡快分離培養(yǎng)，離心后，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放。

5.動物組織取材——鼠胚組織

（1）用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動物；

（2）將其浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘后取出動物；

（3）在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開皮膚；

（4）用無菌操作法解剖取胚。

6.動物組織取材——幼鼠胚腎(或肺)

幼鼠采用上述方法處死消毒后→腹部朝上固定在木板上，先切開游離毛皮并拉開至兩側(cè)→采用無菌法打開胸腔取肺，或從背部打開腹腔取腎。

7.雞(鴨)鳥類胚胎組織

（1）取孵化至適當胚齡(9~12天)的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運動的胚蛋，說明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置；

（2）將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干;經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼;

（3）用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚;

（4）用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無菌平皿中，解剖取材。

   小鼠小膠質(zhì)細胞

大鼠血管平滑肌細胞

原代細胞培養(yǎng)之分離注意事項

1.組織塊培養(yǎng)法

（1）組織塊接種后的前3天，在觀察和移動的過程中，注意不要引起液體的振蕩。要避免經(jīng)常翻動和振動，否則組織塊不易附著于瓶壁上或附著后也會脫落飄起。

（2）加入的培養(yǎng)液不宜過多，避免浸泡的組織塊受輕微的波動而脫落下來。

（3）當細胞向外遷徙出來后要注意記錄并去除漂浮的組織塊和殘留的細胞，它們產(chǎn)生的有毒物質(zhì)會影響原代細胞的生長。

（4）為促進組織塊盡快粘貼在培養(yǎng)瓶皿上，可以在種植前先將膠原薄層涂在培養(yǎng)瓶底壁上。

2.貼壁型原代細胞

（1)原代培養(yǎng)的分離細胞在初次接觸體外環(huán)境時，它們之間會互相影響，在這些細胞之間能產(chǎn)生一些促生長的活性物質(zhì)，使細胞彼此互相促進存活和生長。如果接種的細胞密度過低，細胞之間的促生長作用很小，也很難使細胞適應(yīng)從體內(nèi)的組織環(huán)境到被分散后進入獨立生存環(huán)境的變化過程。如果接種的細胞密度過大，會導致營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，代謝廢物積累較快需要經(jīng)常換液和傳代。

（2）適當增大原代培養(yǎng)接種的細胞密度，給培養(yǎng)的細胞提供更多的類似于在體內(nèi)時細胞之間的相互作用，會極大提高原代培養(yǎng)的細胞在體外存活率。待細胞適應(yīng)體外環(huán)境后進行傳代培養(yǎng)時再以較低的密度接種和培養(yǎng)。

（3）盡快使接種的細胞貼壁，是決定培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵?？梢栽诮臃N后先將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h到5h，待細胞貼壁后，再補足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

3.懸浮型原代細胞

（1）必須保持細胞的懸浮狀態(tài)。可以通過增加培養(yǎng)液的黏度來幫助細胞呈懸浮狀態(tài)，如給培養(yǎng)液中加入低濃度的透明質(zhì)酸復合物。在有攪拌裝置的培養(yǎng)器皿內(nèi)加入培養(yǎng)液是，以5ml為限度，否則攪拌時會產(chǎn)生氣泡對細胞造成傷害。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過快，否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染。如果培養(yǎng)液的量在5ml以下，可以采用旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。給懸浮培養(yǎng)的細胞換液時要注意不要吸出細胞。

（2）能夠進行懸浮培養(yǎng)的細胞，其生命力一般都比較旺盛，體外分裂增殖的速度較快，營養(yǎng)成分消耗大，換液時間隔一般較短。