在ELISA 實(shí)驗(yàn)過程中，抗原和抗體的質(zhì)量是實(shí)驗(yàn)是否成功的關(guān)鍵因素。要求所用抗原純度高，抗體效價高、親和力強(qiáng).

抗單克隆或多克隆抗體都可以用作夾心ELISA系統(tǒng)中的捕獲和檢測抗體。單克隆抗體對單個表位具有固有的特異性，可以對抗原的微小差異進(jìn)行精細(xì)檢測和定量。多克隆抗體通常用作捕獲抗體，然后，在夾心ELISA檢測中將單克隆抗體用作檢測抗體，以提供更高的特異性。除了使用傳統(tǒng)的單克隆抗體外，重組單克隆抗體也可用于ELISA。例如，免重組抗體衍生自產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系，該細(xì)胞系經(jīng)過改造可表達(dá)特定的抗體重鏈和輕鏈DNA序列。與衍生自雜交瘤的傳統(tǒng)單克隆抗體相比，重組抗體不易受細(xì)胞系漂移或批次間差異的影響，因此可實(shí)現(xiàn)峰值抗原特異性。

選擇抗體的另一個設(shè)計考慮因素是成本。生產(chǎn)多克隆抗體通常比單克隆抗體便宜(約5倍)。必須權(quán)衡通過將單克隆抗體同時用于捕獲和檢測抗體獲得的特異性與生產(chǎn)兩種單克隆抗體所需的成本和時間的權(quán)衡。另外，準(zhǔn)備“自夾心" ELISA分析(使用相同的抗體進(jìn)行捕獲和檢測)可能會限制最終ELISA的動態(tài)范圍和靈敏度。

1) 重組免單克隆抗體: 抗體源自可生成免單克隆抗體的細(xì)胞系，并通過分離及克隆特定抗體的重鏈和輕鏈 DNA 序列而產(chǎn)生。ABfinity 單克隆抗體產(chǎn)自克隆文庫分離出的單一克隆。

優(yōu)勢: a.具有兔單抗的高特異性和高靈敏性

b.重組生產(chǎn)，批次間穩(wěn)定一致

c.只結(jié)合單個表位的單克隆抗體

d.無動物源生產(chǎn)

e.儲存 DNA 庫而非細(xì)胞庫

注意事項: a.無多表位結(jié)合

2) 重組兔寡克隆抗體:

優(yōu)勢: a.具有免抗體的高特異性和高靈敏性

b.重組生產(chǎn)，批次間穩(wěn)定一致

c.通過DNA文庫表達(dá)生產(chǎn)的多表位結(jié)合位點(diǎn)

d.無動物源

e.儲存DNA庫而非細(xì)胞庫

注意事項:a無單表位結(jié)合b.由于多表位結(jié)合，可能觀察到更多交叉反應(yīng)性

3) 噬菌體展示重組單克隆抗體:

噬體展示重組單克隆抗體，經(jīng)由編碼抗體可變區(qū)的 DNA 序列跟編碼包膜蛋白的噬菌體基因融合后表達(dá)。因此，噬菌體包膜在其表面表達(dá)抗體融合蛋白

優(yōu)勢: a重組生產(chǎn)帶來的批次間一致性b，單表位結(jié)合c.無動物源生產(chǎn)d.儲存 DNA庫而非細(xì)胞庫

注意事項: 噬菌體展示抗體相比動物源抗體可能親和性更低b.噬菌體展示抗體缺少糖基化c.無多表位結(jié)合

4)單克隆抗體:

單克隆抗體源自雜交瘤細(xì)胞。它們的生產(chǎn)包括接種動物(經(jīng)常用的是小鼠)，分離其脾細(xì)胞，然后同親本細(xì)胞融合。所得雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過表征后篩選克隆用于抗體生產(chǎn)

優(yōu)勢:

1. 單克隆雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)，批次間穩(wěn)定一致

b，單表位結(jié)合

注意事項:

a隨著時間推移單克隆抗體會呈現(xiàn)細(xì)胞漂移b.無多表位結(jié)合c.需要考慮單克隆抗體的同型特異性

5) 免單克隆抗體: 兔單克隆抗體源自雜交瘤細(xì)胞。它們的生產(chǎn)包括接種兔，分離其脾細(xì)胞，然后同親本細(xì)胞融合。所得雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過表征后篩選克隆用于抗體生產(chǎn)

優(yōu)勢:

具有兔全部天然抗體庫帶來的高特異性

b.單表位結(jié)合

c.兔中的單個同種型

注意事項:

隨著時間推移，兔雜交瘤比小鼠雜交瘤更快呈現(xiàn)細(xì)胞漂移 (cell-line drift)b.無多表位結(jié)合

6)多克隆抗體:

多克隆抗體源自動物免疫產(chǎn)生的 B 細(xì)胞?？贵w從動物血清純化，包括結(jié)合抗原上不同表位的多種抗體。

優(yōu)勢;

a多表位結(jié)合

b.使用全部天然抗體庫帶來的高特異性

注意事項:

a每次動物免疫會造成批次間差異性 b.無單表位結(jié)合 由于多表位結(jié)合，更有可能觀察到交叉反應(yīng)性

二抗:

二抗是指用于靶向結(jié)合一抗的抗體。再多種免疫印跡、ELISA以及免疫熒光等免疫實(shí)驗(yàn)中，二抗經(jīng)常和一抗結(jié)合使用以檢測目標(biāo)蛋白。很多二抗都帶有標(biāo)記物，例如Alexa Fluor熒光染料或辣根過氧化物酶（HRP）,從而使二抗的信號可以被檢測到。

實(shí)驗(yàn)中也可以使用帶有標(biāo)記物的一抗，但是二抗有很多優(yōu)點(diǎn)。無論是使用哪種一抗進(jìn)行檢測，使用二抗可便于更換不同的標(biāo)記物。例如，同樣的一抗可以與HRP標(biāo)記二抗一起用于免疫印跡，也可以與另一種Alexa Fluor 488英光標(biāo)記二抗一起用于免疫熒光實(shí)

驗(yàn)

另外，二抗結(jié)合在抗原位置的標(biāo)記染料比直標(biāo)一抗要多，從而增強(qiáng)檢測信號。使用二抗可以避免對一抗進(jìn)行復(fù)雜且昂貴的化學(xué)標(biāo)記(偶聯(lián))，而且偶聯(lián)反應(yīng) (具有氨基酸特異性)可能干擾一抗對抗原的識別。

選擇最佳的二抗要考慮以下因素: a.種屬來源和種屬反應(yīng)性 b.特異性反應(yīng)c.純化方法d.交叉吸附e.多重檢測能力f，抗體類型和亞型g.完整抗體還是抗體片段h.標(biāo)記物i.生物素結(jié)合蛋白

抗體對:

由于抗體的選擇對實(shí)驗(yàn)的影響比較大，所以我們建議選擇配對的抗體進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，配對抗體指的是可以同時結(jié)合在一個抗原分子上的兩個抗體。配對抗體，一般應(yīng)用于夾心ELISA實(shí)驗(yàn)。配對抗體的制備與篩選過程復(fù)雜，即使兩個抗體針對的是不同的抗原決定簇，也并不意味著這兩個抗體分子一定可以同時與抗原分子結(jié)合。當(dāng)一個抗體與抗原結(jié)合后，有可能會導(dǎo)致其他結(jié)合位點(diǎn)(抗原決定族)構(gòu)型的改變，從而導(dǎo)致其他的抗體無法正常結(jié)合到抗原上。位阻效應(yīng)的存在，也可能使兩個結(jié)合位點(diǎn)距離較近的抗本無法同時結(jié)合在抗原上。因此想要得到可以同時結(jié)合在抗原分子上的配對抗體，在制備出抗體后，還需要對得到的抗體進(jìn)行篩選。因此我們建議選擇制備與篩選好的，已經(jīng)過測試的匹配抗體對產(chǎn)品進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

品牌Thermo Fisher

ELISA抗體對產(chǎn)品

名稱 IL-6 Human Matched Antibody Pair 貨號 CHC1263 10X96 T

名稱IL-4 Human Matched Antibody Pair 貨號CHC1283 10X96 T

名稱IL-8 Human Matched Antibody Pair 貨號CHC1303 10X96 T

名稱IL-2 Human Matched Antibody Pair貨號CHC1243 10X96 T

名稱IL-10 Human Matched Antibody Pair貨號CHC1323 10X96 T

名稱IL-12 p70 Human Matched Antibody Pair貨號CHC1563 10X96 T

名稱IL-1 beta Human Matched Antibody Pair貨號CHC1213 10X96 T

名稱MMP3 Human Matched Antibody Pair貨號CHC1543 10X96 T

名稱IL1RA Human Matched Antibody Pair 貨號CHC1183 10X96 T

名稱CXCL10 Human Matched Antibody Pair 貨號CHC2363 10X96 T

大鼠

名稱IL -6 Rat Matched Antibody Pair 貨號CRC0063  10X96 T

名稱IL-4 Rat Matched Antibody Pair  貨號BMS628MST 10X96 T

小鼠

名稱IP-10/CXCL10 Mouse Matched Antibody Pair 貨號BMS6018MST 10X96T

名稱IL-13 Mouse Matched Antibody Pair 貨號CMC2223 10X96 T

豬

名稱IL10 Porcine Matched Antibody Pail 貨號CSC0103 10X96 T

名稱IL-2 Porcine Matched Antibody Pair 貨號CSC1243 10X96 T

猴

名稱ICAM-1(Soluble) Monkey Matched Antibody Pair貨號BMS648MST 10X96T

名稱TNF alpha Monkey Matched Antibody Pair 貨號BMS654MST 10X96 T

雞

名稱IFN gamma Chicken Matched Antibody Pair貨號CAC1233